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腎陽虛是由於素體陽虛、年高腎虧、房勞過度、久病傷腎等，使腎陽虧虛，機體失卻溫煦所表現的證候 [1] 。
現階段中國經濟處於高速發展階段，人們生活節奏快，經濟、家庭、工作壓力大，造成精神及身體長期處於過度疲勞《勞倦過度》狀態，這些不良因素的長期存在，使越來越多的青年男性《工作單位主力、家庭經濟主力》也出現了腎陽虛現象，發病年齡趨於年輕化。
與此同時，青年男性性慾強烈，保持著高頻率的性交行為《房事不節》，也易導致腎陽虛。
而腎陽虛衰，命門之火不足，精失所藏易致『性慾冷淡』，為腎陽虛主證之一，臨床上男性主要表現為勃起功能障礙。
無比山藥丸由山藥、熟地、杜仲、巴戟天、肉蓯蓉等 12 味中藥組成，各味藥補腎功效顯著。
據古書記載，無比山藥丸古時常用於治療『丈夫虛勞百損，陽氣衰絕，體無光澤，頭暈目眩，腰髖不遂等』。
臨床上無比山藥丸對腎臟疾病具有一定的治療作用 [2-7] 。
本課題組前期研究發現，無比山藥丸對藥物造成的腎陽虛動物模型的性功能具有良好的改善作用 [8-9] ，但藥物制備的腎陽虛動物模型不能完整地表現該症狀的臨床特點，因此，本研究采用『房事不節＋勞倦過度』的造模方法，建立符合中醫病因和現代人群腎陽虛的模型小鼠，深入探討無比山藥丸對擬人化腎陽虛模型小鼠勃起功能的改善作用，為無比山藥丸拓展臨床應用范圍。
1材料
1.1動物
清潔級雄性 ICR 小鼠 65 隻， 6 ～ 8 周齡，體質量 25 ～ 30 g ，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號 20170005054902 ，動物生產許可證號 SCXK 《滬》 2017-0005 。
清潔級雌性 ICR 小鼠 300 隻， 4 ～ 6 周齡，體質量 20 ～ 25 g ，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號 20170005053699 ，動物生產許可證號 SCXK 《滬》 2017-0005 。
動物於溫度 20 ～ 26 ℃ 、濕度 45% ～ 60% 、 12 h 照明 /12 h 黑暗的環境中飼養。
動物實驗經浙江中醫藥大學實驗動物管理與倫理委員會決議批準《批準號 ZSLL-2017-023 》。
1.2藥品與試劑
無比山藥丸《批號 2013914 》購自杭州胡慶餘堂藥業有限公司；金匱腎氣丸《批號 19032610 》購自北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠；苯甲酸雌二醇註射液《批號 20210119 》購自吉林省華牧動物保健品有限公司；尿酸《 uric acid ， UA 》檢測試劑盒《批號 210913201 》購自美康生物科技有限公司；肌酐《 creatinine ， CR 》、檢測試劑盒《批號 20210918 》、尿素氮《 blood urea nitrogen ， BUN 》檢測試劑盒《批號 20210922 》、超氧化物歧化酶《 superoxide dismutase ， SOD 》檢測試劑盒《批號 20211201 》、丙二醛《 malonaldehyde ， MDA 》檢測試劑盒《批號 20211201 》、谷胱甘肽過氧化物酶《 glutathion peroxidase ， GSH-Px 》檢測試劑盒《批號 202111129 》、一氧化氮《 nitric oxide ， NO 》檢測試劑盒《批號 20211211 》、一氧化氮合酶《 nitric oxide synthase ， NOS 》檢測試劑盒《批號 20211130 》購自南京建成生物工程研究所；環磷酸鳥苷《 cyclic guanosine monophosphate ， cGMP 》檢測試劑盒《批號 20211208-20356B 》、鳥苷酸環化酶《 guanylate cyclase ， GC 》檢測試劑盒《批號 20211208-24742B 》購自泉州市睿信生物科技有限公司；一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒《批號 122321220104 》、 BCA 蛋白定量試劑盒《批號 070721211202 》、十二烷基硫酸鈉 – 聚丙烯酰胺凝膠快速配制試劑盒《批號 041221210804 》、電泳液《批號 121120210422 》、轉膜液《批號 022021210719 》購自碧雲天生物技術研究所；兔源內皮型一氧化氮合酶《 endothelial nitric oxide synthase ， eNOS 》抗體《批號 GR3422361-4 》購自英國 Abcam 公司；兔源 GC 抗體《批號 LL0422 》購自成都正能生物技術有限公司；兔源 β-actin 抗體《批號 B9901 》購自美國 ImmunoWay 公司； HRP 標記的山羊抗兔 IgG 抗體《批號 HP0119 》購自杭州華安生物科技有限公司。
1.3儀器
YLS-13A 型大小鼠抓力測定儀、 YLS-1A 型多功能小鼠自動活動記錄儀《山東省醫學科學院設備站》； TBA-40FR 型全自動生化分析儀《東芝醫療系統株式會社》； MicroCL17 型微量離心機《美國 Thermo Fisher Scientific 公司》； PowerWave340 型酶標儀《美國 BioTek 公司》； AXIOSCOPE.A1 型蔡司正置熒光顯微鏡《德國 CarlZeissAG 公司》； SCIENTZ-48 型高通量組織研磨器《寧波新芝生物科技有限公司》； EPS300 型電泳電壓儀《上海天能科技有限公司》； QuickChemi 5200 型化學發光成像儀《杭州莫納生物科技有限公司》。
2方法
2.1動情期雌鼠的準備及雄鼠的篩選
2.1.1動情期雌鼠準備 將雌鼠進行輸卵管結紮手術，術後恢復 2 周，連續 2 d ig 苯甲酸雌二醇《 0.02 mg/g 》，第 3 天通過陰道塗片檢查角化細胞，篩選發情狀況良好的雌鼠。
2.1.2雄鼠的篩選 前 1 d 晚上將每隻雄鼠與 2 隻動情期雌鼠共籠，次日早晨，檢查籠內雌鼠陰部，發現有陰道栓說明有過交配行為，將籠內雄鼠取出作為實驗用。
2.2分組、造模及給藥
將篩選出具有良好性能力的雄鼠 60 隻，按體質量隨機分成對照組、模型組、金匱腎氣丸《 1.7 g/kg ，溶於蒸餾水配制成 0.170 g/mL 的溶液》組和無比山藥丸低、中、高劑量《 0.75 、 1.50 、 3.00 g/kg ，分別相當於臨床劑量的 2.5 、 5 、 10 倍，溶於蒸餾水分別配制成 0.075 、 0.150 、 0.300 g/mL 的溶液》組。
除對照組外，其餘各組每日 8: 00 時強迫小鼠遊泳至無力而下沉至水面以下 5 s 不上浮時撈出，以誘導勞倦過度，同時根據 Colldege 效應《雄鼠與 1 隻發情期雌鼠交配完後又會和新的發情雌鼠交配》，每隻雄鼠與 5 隻動情期雌鼠同籠，並且每日更換動情期雌鼠以誘導房事不節 [10] 。
連續造模 8 周。
造模期間每日 ig 相應藥物《 10 mL/kg 》。
腎陽虛證模型建立成功的判斷標準：根據國家技術監督局發佈的『中醫臨床診療術語』中腎陽虛證的判斷標準，當小鼠出現腰膝酸軟《抓力減小》、畏寒肢冷《抱團少動、肛溫降低、尾部微循環血流量減少》及性慾減退《捕捉、騎跨行為減弱》等腎陽虛主證，精神萎靡《自主活動降低》、發槁齒搖《皮毛無光澤》等腎陽虛次證，認定造模成功。
實驗中模型組及無比山藥丸高劑量組各死亡 1 隻， 2 組納入統計為 9 隻，其餘各組納入統計為 10 隻。
2.3檢測腎陽虛證候指標
2.3.1形態學觀察 造模給藥期間觀察小鼠的活動情況、精神狀態、毛發色澤等，觀察模型組小鼠是否出現畏寒喜暖、抱團少動、精神萎靡、形體消瘦、體毛疏鬆、雜亂無光澤等一系列類似腎陽虛的表現。
2.3.2肛溫 造模給藥第 4 周，在安靜環境下，將溫度計插入小鼠肛門處，當溫度計穩定後記錄所測數據，測定 3 次，取平均值。
2.3.3自主活動次數 造模給藥第 4 周，在下午安靜昏暗環境下，將小鼠放入自主活動箱內，適應 5 min 後，記錄接下來 5 min 內小鼠的活動次數。
2.3.4抓力 造模給藥第 4 周，應用抓力測定儀測定小鼠抓力，每隻小鼠測定 3 次，取平均值。
2.4檢測尾部微循環血流量
造模給藥第 5 周，用異氟烷呼吸麻醉機對小鼠進行呼吸麻醉，使用 MoorFLPI 散斑全幀實時掃描成像系統測定小鼠尾部微循環血流量。
測量起點靠近小鼠尾根部，每隻小鼠盡量保持測量位置一致。
在檢測區域長度范圍內，固定分佈 3 個測量點，測量時間為 30 s ，掃描速度為 25 Hz/s 。
檢測期間保持環境相對安靜，避免對測定產生影響，使用 MoorFLPI ReviewV 3.0 軟件對所記錄的 3 個測量點數據進行處理，取平均值。
2.5檢測雄鼠性行為指標
造模給藥第 8 周，通過對雌鼠制備陰道塗片，選取發情狀態良好的雌鼠用於交配實驗，來檢測雄鼠性行為《捕捉、騎跨的次數及潛伏期》。
於 19: 00 時開始，在昏暗且能觀察的安靜環境下，按文獻方法 [5] 觀察記錄 20 min 內雄鼠的性行為情況。
2.6觀察腎臟組織病理變化
末次給藥後，小鼠眼眶取血致死，剝離腎組織，置於 4% 中性福爾馬林固定液中，固定、脫水、包埋、切片，制得 4 μm 石蠟切片，進行蘇木素 – 伊紅《 HE 》染色，於顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。
2.7檢測腎臟組織細胞凋亡情況
取腎臟組織石蠟切片，按 TUNEL 試劑盒說明書操作，用抗熒光淬滅封片液封片後在熒光顯微鏡下觀察，觀察到的熒光細胞為凋亡細胞。
2.8檢測腎功能指標
小鼠眼眶取血致死後，離心取上層血清，用全自動生化分析儀檢測血清中 UA 、 CR 和 BUN 水平。
2.9檢測腎臟氧化指標
小鼠處死後，取腎臟，按 1 ∶ 9 比例加入生理鹽水，利用組織研磨器研磨制備勻漿， 3500 r/min 離心 10 min ，取上清液，按試劑盒說明書測定 SOD 、 GSH-PX 活性和 MDA 水平。
2.10檢測陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性
末次給藥後，解剖取小鼠陰莖組織，用生理鹽水沖洗，稱取陰莖組織，剪碎後加入蛋白裂解液，以組織研磨器制備為勻漿液，冰中裂解 30 min ， 4 ℃、 12 000 r/min 離心 10 min ，取上清液，按試劑盒說明書測定陰莖組織中 NO 、 cGMP 水平和 NOS 、 GC 活性。
2.11檢測陰莖組織中eNOS和GC蛋白表達
取『 2.10 』項中的上清液，采用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉 – 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至 PVDF 膜，於 5% 脫脂牛奶中室溫封閉 2 h ，分別加入 β-actin 、 eNOS 、 GC 抗體， 4 ℃孵育過夜， PBST 溶液漂洗 3 次；加入相應二抗，室溫孵育 2 h ， PBST 溶液漂洗 3 次，采用化學發光成像儀進行蛋白條帶曝光檢測，並用 Image J 軟件進行結果分析。
2.12調節腎功能與勃起功能相關性分析
應用 SPSS 軟件 Pearson 相關性分析法，計算出腎功能指標數據 UA 、 CR 、 BUN 《 X 》與勃起功能相關指標 NO 、 NOS 《 Y 》之間的相關系數《 r 》。
r 的絕對值越大《即越接近於 1 或 −1 》，則相關度和相關性越強；若 r 為正值則表示 2 個變量的關系呈正相關；若 r 為負值則呈負相關。
2.13統計學分析
采用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，所有數據以 表示，組間比較采用單因素方差分析及t 檢驗。
3結果
3.1無比山藥丸對小鼠腎陽虛證候的影響
與對照組比較，模型組小鼠出現抱團少動、行動遲緩、毛發無光澤、小便清長等類似腎陽虛證候表現；與模型組比較，各給藥組小鼠狀態明顯好轉。
如表 1 所示，與對照組比較，模型組小鼠自主活動次數、抓力值和肛溫均顯著下降《 P ＜ 0.01 》；與模型組比較，各給藥組小鼠自主活動次數和抓力值均顯著升高《 P ＜ 0.01 》；金匱腎氣丸組和無比山藥丸低、中劑量組小鼠肛溫顯著升高《 P ＜ 0.05 、 0.01 》。
3.2無比山藥丸對小鼠尾部微循環血流量的影響
如圖 1 和表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠尾部微循環血流量顯著降低《P ＜0.01 》；與模型組比較，無比山藥丸各劑量組小鼠尾部微循環血流量均顯著升高《P ＜0.05 、0.01 》。
3.3無比山藥丸對小鼠性行為的影響
如表3 所示，與對照組比較，模型組小鼠捕捉潛伏期顯著延長《P ＜0.01 》，捕捉次數顯著減少 《P ＜0.01 》，並且未觀察到騎跨行為；與模型組比較，各給藥組小鼠捕捉潛伏期顯著縮短《P ＜0.01 》，捕捉次數顯著增加《P ＜0.01 》，騎跨行為明顯改善《P ＜0.05 、0.01 》。
3.4無比山藥丸對小鼠腎組織病理變化的影響
如圖2 所示，對照組小鼠腎臟結構完整，腎小球、腎小管結構清晰，皮質、髓質結構無異常改變。
與對照組相比，模型組小鼠腎體積增大，腎小球萎縮、硬化，腎小管擴張成囊狀。
與模型組相比，各給藥組小鼠腎體積減小，腎小球萎縮硬化症狀減輕，腎小管擴張情況減少。
3.5無比山藥丸對小鼠腎組織細胞凋亡的影響
如圖3 所示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟凋亡細胞數量增加，主要見於腎小球和腎錐體中的腎小管中，嚴重影響腎小球的濾過作用和腎小管的重吸收作用，故觀察到模型小鼠小便清長的現象。
與模型組相比，各給藥組腎臟組織凋亡細胞數量均減少。
3.6無比山藥丸對小鼠腎功能指標的影響
如表4 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中CR 、UA 和BUN 水平均顯著升高《P ＜0.01 》；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中CR 、UA 和BUN 水平均顯著降低《P ＜0.05 、0.01 》。
3.7無比山藥丸對小鼠腎臟氧化指標的影響
如表 5 所示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟組織中 MDA 水平顯著升高《 P ＜ 0.01 》， SOD 和 GSH-Px 活性均顯著下降《 P ＜ 0.05 》；與模型組比較，各給藥組小鼠腎臟組織中 MDA 水平顯著下降《 P ＜ 0.01 》，金匱腎氣丸組和無比山藥丸中、高劑量組小鼠腎臟組織中 SOD 和 GSH-Px 活性均顯著升高《 P ＜ 0.05 、 0.01 》。
3.8無比山藥丸對小鼠陰莖組織中NO、cGMP水平和NOS、GC活性的影響
如表 6 所示，與對照組比較，模型組小鼠陰莖組織中 NO 、 cGMP 水平和 NOS 、 GC 活性均顯著降低《 P ＜ 0.01 》；與模型組比較，各給藥組小鼠陰莖組織中 NO 和 cGMP 水平均顯著升高《 P ＜ 0.05 、 0.01 》，無比山藥丸各劑量組小鼠陰莖組織中 NOS 活性顯著升高《 P ＜ 0.01 》，金匱腎氣丸組和無比山藥丸中、高劑量組小鼠陰莖組織中 GC 活性顯著升高《 P ＜ 0.05 、 0.01 》。
3.9無比山藥丸對小鼠陰莖組織中eNOS和GC蛋白表達的影響
如圖 4 所示，與對照組比較，模型組小鼠陰莖組織中 eNOS 和 GC 蛋白表達水平均顯著降低《 P ＜ 0.01 》；與模型組比較，無比山藥丸各劑量組小鼠陰莖組織中 eNOS 和 GC 蛋白表達水平均顯著升高 《 P ＜ 0.01 》，金匱腎氣丸組小鼠陰莖組織中 eNOS 蛋白表達水平顯著升高《 P ＜ 0.01 》。
3.10腎功能與勃起功能相關性分析
如圖5 和表7 所示，經SPSS 軟件分析可知腎功能指標與勃起功能指標呈負相關，其中UA 與NO 、NOS 存在顯著性差異《P ＜0.05 、0.01 》。
4討論
腎陽虛證為中醫常見證候，由腎陽虧虛、機失溫煦所致。
腎陽，又稱命門之火，為人體陽氣之根本。
腎陽足，全身之陽亦足，則生命力強壯。
若房勞過度，耗傷腎精，可致腎陽虛。
無比山藥丸出自『太平惠民和劑局方』，由山藥、熟地黃、杜仲、肉 蓯蓉等 12 味中藥組成。
各味藥物配伍可奏健脾補腎之功，用於脾腎兩虛、食少肌瘦、腰膝酸軟、目眩耳鳴。
本課題組前期研究發現無比山藥丸補腎功效顯著，對於腎陽虛證具有良好的療效。
腎陽虛主症有腰膝酸軟、畏寒肢冷、性慾減退 [11] ，次症有精神萎靡、夜尿頻多、下肢浮腫等。
本研究中采用抓力量化腎陽虛證之『腰膝酸軟』；肛溫、尾部微循環血流量量化腎陽虛證之『畏寒肢冷』；捕捉、騎跨《潛伏期、次數》行為量化腎陽虛證之『性慾減退』；自主活動次數量化腎陽虛證之『精神萎靡』。
結果顯示，無比山藥丸可增加模型小鼠抓力，升高肛溫，增加尾部微循環血流量，縮短捕捉、騎跨潛伏期，增加捕捉、騎跨次數，增加模型小鼠自主活動次數。
通過上述證候指標結果提示，無比山藥丸可改善『房事不節＋勞倦過度』致腎陽虛模型小鼠腰膝酸軟、畏寒肢冷、性慾減退、精神萎靡等症狀。
房勞是中醫理論上一個特有的發病因素。
由於房事過多、勞累過度導致機體過度損耗從而會引起疾病的發生 [12] 。
『靈樞 · 邪氣臟腑病形』明確指出：『有所用力舉重，若入房過度，汗出浴水，則傷腎』強調勞力過度和房事不節最耗體內腎陽，先傷腎，腎臟不榮，體內陽氣耗竭，精失溫煦，則不行其職，易致腎陽虛。
因此，『房事不節＋勞倦過度』能夠引起腎功能的低下。
臨床上，血清 CR 、 UA 、 BUN 水平可反映腎小球的濾過作用，是檢測腎功能的重要指標。
本研究結果顯示，無比山藥丸可降低模型小鼠血清 CR 、 UA 和 BUN 水平。
腎臟發揮正常的生理功能與其組織結構的完整性密不可分。
HE 染色結果顯示，無比山藥丸能改善模型小鼠腎小球萎縮、腎小管擴張等； TUNEL 染色結果顯示，無比山藥丸能減少模型小鼠腎小球和腎小管中細胞凋亡。
其可能與無比山藥丸改善模型小鼠腎臟氧化損傷有關，結果顯示，無比山藥丸能降低模型小鼠腎臟中 MDA 水平，升高 SOD 和 GSH-PX 活性。
『素問 · 痿論篇』提及『入房太甚，宗筋弛縱』指房事過多會導致男子前陰痿弱不舉。
清代韓善微『陽痿論』曰：『陽者，男子之外腎，痿者，弱也；弱而不用，欲舉而不能之謂』而腎陽，又稱命門之火，為人體陽氣之根本，能夠增強臟腑組織器官的功能活動。
腎陽溫煦、推動陰莖勃起，因此陽痿乃『腎虛不能榮於陰器，故萎弱也』所以『房事不節＋勞累過度』最終會導致男子性功能低下。
勃起功能障礙是男性性功能低下的主要表現之一 [13] ，其中勃起功能障礙是指陰莖持續不能達到或維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活，病程在3 個月以上[14] 。
研究證明，NO-cGMP 途徑對於維持陰莖勃起起到關鍵的調控作用，NO 作為一種內源性信號分子，由NOS 催化產生，可通過激活GC ，將三磷酸鳥苷轉化為cGMP ，作用於鈣離子通道，鬆弛平滑肌，促使血液進入陰莖動脈和海綿竇間隙，引起陰莖勃起[15-16] 。
因此，任何引起陰莖海綿體中NO 減少的因素都可能導致勃起功能障礙的發生。
本研究結果顯示，無比山藥丸能縮短模型小鼠捕捉、騎跨行為潛伏期，增加捕捉、騎跨次數，故能改善模型小鼠陰莖勃起能力，並且能增加陰莖組織中NO 、cGMP 水平，增強陰莖組織中NOS 、GC 活性，上調NO-cGMP 途徑中eNOS 和GC 蛋白表達。
中醫認為腎主生殖，男性陽痿與腎臟不榮密切相關。
本研究中將腎功能指標與勃起功能指標利用 SPSS 軟件進行Pearson 相關性分析，發現UA 與NO 、NOS 之間呈顯著負相關。
研究表明，高UA 水平對機體NO 的表達有著重要的影響[17] 。
高尿酸血症時體內氧自由基增多，促進氧自由基與NO 反應增強，從而消耗了大量NO ，導致NO 含量下降[18] 。
故推測『房事不節＋勞倦過度』導致的勃起功能障礙可能與UA 介導的NO-cGMP 途徑有關。
本研究結果顯示，無比山藥丸能夠改善『房事不節＋勞倦過度』導致的模型小鼠腎陽虛之腰膝酸軟、畏寒肢冷、性慾減退、精神萎靡等症狀；改善模型小鼠腎功能損傷和勃起功能障礙。
其作用機制可能與尿酸介導的 NO-cGMP 途徑有關。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻《略》
來 源：金小虎，蘇 潔，陳思敏，鐘玉瀅，周意情，洪亞男，葉 威，陳 煒，陳素紅，呂圭源．無比山藥丸對腎陽虛模型小鼠勃起功能障礙的作用及機制研究 [J]. 中草藥，2022，53(17): 5400-5408.
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